提取核酸的时候磁珠团聚结块怎么办?
发布时间:
2025-06-30 10:23
在核酸提取过程中,若磁珠出现团聚结块,会导致核酸结合效率下降、洗涤不彻底或回收率降低。分析以下原因和解决办法。
一、磁珠团聚的常见原因
1. 磁珠储存不当:反复冻融、长期置于高温或剧烈震荡。
2. 缓冲液问题:裂解液或洗涤液pH异常、盐浓度不当或含有沉淀。
3. 操作不当:混匀不充分、磁珠干燥过度或静置时间过长。
4. 样本问题:高粘度样本(如全血、植物组织)或过量杂质(多糖、蛋白)。
二、解决方案
1. 磁珠预处理
涡旋重悬:使用前剧烈涡旋磁珠悬液≥30秒,确保完全分散(肉眼观察无沉淀)。
短暂离心:低速离心(2000 rpm, 5秒)使管壁液滴聚集,便于重悬。
超声处理(可选):对顽固结块,用水浴超声仪短暂超声(10秒,避免产热)。
2. 优化操作步骤
充分混匀:加入磁珠后,立即用移液器吹打10次或涡旋10秒,在裂解和洗涤步骤中,每步混匀需彻底(避免磁珠吸附在管壁)。
避免磁珠干燥:乙醇洗涤后尽快进入下一步,干燥时间≤10分钟(肉眼见磁珠微湿润)。
控制静置时间:磁珠结合核酸时,静置时间按说明书操作(通常3-5分钟),过长易结块。
3. 调整缓冲液条件
检查缓冲液pH和盐浓度:
裂解液pH应为碱性(如pH 8.0-8.5),若沉淀需更换新批次。
确保洗涤液(如80%乙醇)新鲜配制,无水分挥发导致的浓度变化。
添加助悬剂(谨慎使用):对高粘度样本,可加入0.1% Tween-20(终浓度)改善分散性(需验证兼容性)。
4. 样本优化
稀释或预处理:
高粘度样本(如全血)用缓冲液稀释后再裂解。
植物/真菌样本先用液氮研磨或CTAB法去除多糖多酚。
减少样本量:
结块严重时,降低样本起始量(如血液从200μL减至100μL)。
5. 磁珠保存与质量控制
正确储存:磁珠保存于2-8℃(避免冷冻),使用前平衡至室温。
验证磁珠活性:取少量磁珠加入清水,正常应均匀分散;若结块则提示磁珠失效。
三、紧急补救措施
若实验中发现磁珠结块:
1. 暂停实验:立即涡旋或吹打尝试重悬。
2. 延长结合时间:结块时延长核酸结合时间至10分钟(轻柔摇晃)。
3. 离心后重悬:低速离心(1000 rpm, 1分钟),吸弃上清,用新鲜洗涤液重悬。
四、预防措施
分装磁珠:避免反复冻融和长时间室温暴露。
定期校准移液器:确保试剂体积准确,避免盐浓度偏差。
选择低吸附耗材:使用硅化离心管减少磁珠粘附。
- 问题排查表
现象 |
可能原因 |
解决方案 |
磁珠沉底不分散 |
储存不当/过期 |
涡旋+超声,更换新批次 |
结合后结块 |
样本杂质过多 |
稀释样本或增加预处理 |
洗涤时结块 |
乙醇浓度不准 |
新鲜配制80%乙醇 |
通过以上方法,可有效解决磁珠团聚问题。若持续存在,欢迎咨询上海雷火竞技18103799069
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